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- Cómo leen los biólogos un gen con secuenciación de ADN
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Por René Fester Kratz
La secuenciación del ADN, que determina el orden de los nucleótidos en una cadena de ADN, permite a los científicos leer el código genético para que puedan estudiar las versiones normales de los genes. También les permite hacer comparaciones entre las versiones normales de un gen y las versiones que causan enfermedades de un gen.
Después de conocer el orden de los nucleótidos en ambas versiones de un gen, pueden identificar qué cambios en el gen causan la enfermedad.
La secuenciación del ADN se basa en un tipo especial de nucleótido, llamado ddNTP (abreviatura de dideoxirribonucleótido trifosfato). Los ddNTPs son algo similares a los nucleótidos regulares de ADN, pero son lo suficientemente diferentes como para detener la replicación del ADN.
Cuando se añade un ddNTP a una cadena creciente de ADN, la ADN polimerasa no puede añadir más nucleótidos, por lo que la cadena de crecimiento se detiene en ese punto. La secuenciación del ADN utiliza esta interrupción de la cadena para determinar el orden de los nucleótidos en una cadena de ADN.
La mayoría de las secuencias de ADN que se realizan hoy en día son secuencias cíclicas (que se muestran en la figura), un proceso que funciona como la PCR para crear muchas copias del gen que se va a secuenciar. Pero, a diferencia de la PCR, los ddNTPs así como los nucleótidos regulares se añaden a la mezcla. Así que, a medida que la polimerasa de ADN trabaja haciendo muchas copias del gen, de vez en cuando toma un ddNTP (mostrado como rectángulos blancos) en lugar de un nucleótido regular (mostrado como rectángulos negros).
Después de añadir un ddNTP a una molécula de ADN en crecimiento, se detiene la replicación. El resultado final de la secuenciación del ciclo son muchas copias parciales del gen a secuenciar, todas las cuales se detienen en diferentes puntos y, por lo tanto, tienen diferentes longitudes.
Después de hacer las copias parciales, los científicos las cargan en una máquina que utiliza electroforesis en gel para ordenar las copias por tamaño. A medida que las secuencias parciales pasan a través de la máquina, un láser lee una etiqueta fluorescente en cada ddNTP, que revela el orden de los nucleótidos en el gen.
Ponga a prueba su comprensión lectora de ddNTP con estas preguntas de práctica:
- Un científico quiere determinar la secuencia de un gen asociado con una enfermedad genética. Toma muestras de ADN de una persona que tiene la versión causante de la enfermedad del gen en cuatro tubos de ensayo separados, cada uno de los cuales contiene nucleótidos, polimerasa de ADN e iniciadores. Luego, en cada tubo, agrega un tipo de dideoxinucleótido – ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP – para que cada tubo produzca fragmentos de ADN que terminan con un nucleótido en particular (A, G, C, o T). Después de ejecutar las reacciones de secuenciación, carga los resultados de cada tubo en un gel y separa los fragmentos mediante electroforesis en gel. Basado en los resultados en su gel, mostrados en esta figura, ¿cuál es la secuencia del gen?
- Una mujer joven cuya madre murió de Alzheimer de inicio temprano quiere saber si está en riesgo de desarrollar la enfermedad. La enfermedad es causada por un alelo dominante, así que si la mujer tiene sólo una copia del alelo causante de la enfermedad, desarrollará la enfermedad. Describa cómo un científico podría usar una muestra de sangre de la joven para detectar la presencia del alelo causante de la enfermedad. Asegúrese de incluir todas las técnicas necesarias, comenzando con la muestra de sangre.
- El ADN viaja hacia el electrodo positivo de un gel, y los fragmentos más pequeños se mueven a la mayor distancia, por lo que las bandas del gel que están más cerca del + son las más pequeñas. El fragmento más corto (la banda más baja) está en el carril que fue cargado con ddCTPs, así que el primer nucleótido en la cadena de ADN debe ser C. La siguiente banda está en el carril que fue cargado con ddTTPs, por lo que el siguiente nucleótido debe ser T. La siguiente banda está de nuevo en el carril C, por lo que el siguiente nucleótido debe ser una C. Si continúa leyendo el gel desde el lado + hacia el lado – el lado -, en otras palabras, desde la parte inferior hacia la parte superior -, usted puede calcular el resto de la secuencia de ADN. La secuencia completa es CTC AGC CAT AGG.
- El científico extraería ADN de la muestra de sangre y luego usaría ya sea la secuenciación de ADN o enzimas de restricción para determinar si la mujer joven es portadora del alelo causante de la enfermedad.método de secuenciación de ADN: El científico lee las secuencias de los alelos de la joven y las compara con las secuencias conocidas de los alelos normales y de la enfermedad. El científico separa la muestra de ADN de la joven y la coloca en cuatro tubos. Cada tubo contiene cebadores para el gen de Alzheimer y muchos nucleótidos. Uno de cada tubo contiene un ddNTP etiquetado fluorescentemente diferente: uno con ddATP, uno con ddCTP, uno con ddGTP y uno con ddTTP. El científico coloca los tubos en un secuenciador de ciclo, donde pasan por muchas rondas de replicación de ADN. Luego, el científico pasa las muestras a través de un gel que las separa por tamaño. La computadora detecta la señal fluorescente al final de cada pieza de ADN desde la más pequeña hasta la más grande y la utiliza para reconstruir las secuencias de ADN para los alelos de la mujer joven: El científico utiliza la PCR en el ADN de la sangre para hacer muchas copias del gen asociado con el Alzheimer. Luego, el científico utiliza una enzima de restricción que se sabe que corta de manera diferente dentro de las formas normales y enfermas del gen. El científico corta la muestra de ADN de la joven con la enzima de restricción y luego separa el ADN mediante electroforesis en gel. El científico compara los tamaños de los fragmentos de ADN producidos por el ADN de la joven con el patrón conocido generado por los alelos normales y de la enfermedad.